O objetivo deste trabalho foi estabelecer as condições operacionais de síntese enzimática de biodiesel catalisada pela lipase de Burkholderia cepacia imobilizada em SiO2-PVA em reator de leito fixo duplo estágio acoplado a uma coluna empacotada com Lewatit® GF202 para remover o glicerol formado como subproduto. Os ensaios de produção foram realizados a 50 °C, empregando os materiais de partida na proporção molar de 1:12 (óleo:etanol) , sendo investigado o efeito do tempo espacial (10 a 16 h) no rendimento de transesterificação e na produtividade. O melhor desempenho do sistema foi obtido empregando tempo espacial de 16 h, proporcionando rendimentos de (96,3 ± 2,1)% e produtividade de (36,7 ± 2,4)mgéster/gmeio/h. As amostras de biodiesel apresentaram viscosidade cinemática de 5,8 ± 0,2 mm2/s; 3,7% m/m de monoacilglicerol e ausência de diacilglicerol. A estabilidade do sistema foi também comprovada revelando tempo meia-vida do biocatalisador de 1512h.